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WB實驗-基礎(chǔ)篇

更新時間：2025-09-19

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WB 實驗即蛋白質(zhì)印跡法，是分子生物學(xué)、生物化學(xué)等領(lǐng)域常用的實驗技術(shù)。它依據(jù)抗原抗體的特異性結(jié)合原理，能對樣品中的特定蛋白質(zhì)進(jìn)行定性或半定量分析。WB 實驗憑借高特異性和靈敏度，在蛋白質(zhì)表達(dá)水平研究、蛋白質(zhì)分子大小鑒定、疾病標(biāo)志物檢測等方面發(fā)揮著重要作用，是生命科學(xué)研究中不ke或缺的有力工具。

實驗原理

WB實驗基于抗原-抗體的特異性結(jié)合反應(yīng)，通過聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白質(zhì)，將其轉(zhuǎn)移至固相載體(如PVDF膜)，再利用特異性一抗和酶標(biāo)記二抗進(jìn)行檢測，最終通過化學(xué)發(fā)光或顯色反應(yīng)實現(xiàn)目標(biāo)蛋白的定性、定位及半定量分析。

實驗步驟

一、樣本制備

1.樣本收集

①貼壁細(xì)胞收集：吸出培養(yǎng)基，向培養(yǎng)皿中加入預(yù)冷的1×PBS，漂洗2次，利用細(xì)胞刮或胰酶消化收集貼壁細(xì)胞，細(xì)胞轉(zhuǎn)移到離心管，離心收集細(xì)胞沉淀。

②懸浮細(xì)胞收集：先離心收集細(xì)胞沉淀，再用預(yù)冷 PBS 輕輕吹打重懸，然后離心收集細(xì)胞沉淀。

③動物組織樣本收集：在冰上用干凈的醫(yī)用剪將組織剪成小塊。然后在液氮中將組織研磨粉碎。

④植物樣本收集：取適量植物組織樣本（葉片等）放置于冷凍液氮中，之后將冷凍后的植物組織放于研缽進(jìn)行研磨，盡可能充分研磨破壞其細(xì)胞壁。

2.總蛋白提取

①細(xì)胞/組織裂解：

細(xì)胞樣本，加入預(yù)冷的裂解緩沖液(含有 PMSF/蛋白酶抑制劑)，冰上裂解 15min。

組織樣本，按照 1mL 裂解液/100mg 組織向勻漿器中加入蛋白裂解液，多次勻漿，直至組織完quan勻漿，收集勻漿液。

②把裂解好的樣本12000rpm離心10min，取上清用于后續(xù)實驗。

③蛋白變性：

吸取 10μl 蛋白上清做蛋白濃度（BCA 法）測定。向剩余的蛋白提取液中加 5× Loading Buffer（最終工作液為 1x)，95℃加熱變性 10min，待液體完quan冷卻后置于-20℃分裝保存，避免反復(fù)凍融。

相關(guān)產(chǎn)品：

二、蛋白濃度測定

1.BCA法

測定原理：在堿性環(huán)境下蛋白質(zhì)與Cu²⁺絡(luò)合并將Cu²⁺還原成Cu⁺。BCA與Cu⁺結(jié)合形成穩(wěn)定的紫藍(lán)色復(fù)合物，在562 nm處有高的光吸收值并與蛋白質(zhì)濃度成正比，據(jù)此可測定蛋白質(zhì)濃度。

特點：靈敏度高，操作簡單，試劑及其形成的紫藍(lán)色復(fù)合物穩(wěn)定性俱佳，并且受干擾物質(zhì)影響小，不受去垢劑的影響。

2.Bradford法

測定原理：在酸性條件下考馬斯亮藍(lán)(Coomassie brilliant blue G-250)與蛋白質(zhì)結(jié)合后，染料的最大吸收峰由465nm變?yōu)?95nm，溶液的顏色由棕色變?yōu)樗{(lán)色，形成的復(fù)合物顏色的深淺與蛋白濃度的高低成正比關(guān)系，因此可以在595 nm波長下測定吸光度值從而計算蛋白含量。

特點：操作簡單，對EDTA、EGTA等還原劑兼容性好，但易受強(qiáng)堿性和高濃度去污劑影響。

3.Lowry法

測定原理：堿性條件下，蛋白質(zhì)與銅作用生成蛋白質(zhì)-銅絡(luò)合物此絡(luò)合物將Folin試劑還原，產(chǎn)生深藍(lán)色，顏色深淺與蛋白質(zhì)含量成正比。

特點：不受脂類物質(zhì)干擾，也能耐受相當(dāng)濃度的去垢劑如SDS。

相關(guān)產(chǎn)品：

三、凝膠電泳

1.制膠

①取干凈的膠板，用水沖洗后，擦拭干凈，對齊插入板夾中。

②檢漏:加入水檢查是否漏水(20min)，將水倒掉，用吸水紙吸干凈。

③配分離膠：取干凈的空燒杯，按照下層膠配比(分離膠)依次加入、混勻。加TEMED之后混合均勻，迅速加入兩板之間，液體加至距短板上約2cm處停止加液。用異丙醇進(jìn)行液封，室溫放置待下層膠凝固(20min)，倒掉上層液體，吸水紙吸干水。

④配濃縮膠：按比例配制濃縮膠，加速混勻，迅速加入兩板之間。插入梳子，室溫放置，待上層膠凝固(20min)。從固定臺上取下夾板，打開夾子。

注：除了添加各種試劑手工配膠，目前還有制膠試劑盒和預(yù)制膠的兩種更加方便快速的制膠方法。

濃縮膠濃度選擇：

2.跑膠

①將膠板上的梳子拔出后，在流水中輕柔沖洗上樣孔，將碎膠沖出孔外。

②將膠板組裝在電泳儀器上，注意短的玻璃板朝電泳槽內(nèi)放置，要對齊夾緊不能漏液。

③加入電泳液，內(nèi)槽必須加滿電泳緩沖液，外槽可以不加滿。

注：注意觀察內(nèi)槽是否漏液，若漏液的話需要重新裝板。

④按照方案將蛋白和marker加入上樣孔中，目的蛋白每孔上樣量20μg-40μg，內(nèi)參蛋白每孔上樣量5μg-10μg。marker的用量參考試劑說明書。

⑤蓋上蓋子，注意不要弄錯方向，連接電源；濃縮膠設(shè)置恒壓80V，跑膠30min左右，然后設(shè)置分離膠恒壓120V，至溴酚藍(lán)到達(dá)膠的底端處附近即可停止電泳。

注：不同的膠跑膠時間可能會有區(qū)別，主要以第一次實驗建議多觀察幾次，記錄跑膠所需要的時間。

相關(guān)產(chǎn)品：

四、轉(zhuǎn)膜

1. 將PVDF膜浸泡在甲醇中激活30s。

注：PVDF膜有0.22μm和0.45μm兩種規(guī)格的，20KD以下蛋白建議選用0.22μm的，20KD以上蛋白建議選用0.45μm的。

2. 電泳結(jié)束后將膠板取出，短玻璃板朝上放置，揭開短玻璃板后切除多余的膠，在水中將膠從長玻璃板上取下。

3. 在電轉(zhuǎn)液中，轉(zhuǎn)膜夾黑色面朝下，依次放置海綿-濾紙-膠-PVDF膜-濾紙-海綿（三明治結(jié)構(gòu)），夾緊轉(zhuǎn)膜夾，PVDF膜要與膠貼合，排走氣泡。調(diào)整轉(zhuǎn)膜夾黑色界面轉(zhuǎn)向轉(zhuǎn)膜槽負(fù)極，白色面朝向轉(zhuǎn)膜槽正極。灌滿轉(zhuǎn)膜液后，用200-400mA恒定電流轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)膜要在冰浴中進(jìn)行。

注：轉(zhuǎn)膜的時間和蛋白大小、電流大小及轉(zhuǎn)膜液的類型有關(guān)。

轉(zhuǎn)膜條件選擇：