產(chǎn)品貨號：P2303

儲存條件：-20℃

產(chǎn)品組成

產(chǎn)品簡介

PNGase F（肽 N-糖苷酶 F）來源于Elizabethkingia miricola，是一種高效的酰胺水解酶，可以裂解由天冬酰胺連接的高甘露糖、雜合和復(fù)雜的寡糖糖蛋白。PNGase F的切割位點為糖蛋白內(nèi)側(cè)N-乙酰葡萄糖胺（GlcNAc）和天冬酰氨殘基之間的酰胺鍵，同時將酶解后蛋白上的天冬氨酰轉(zhuǎn)化為天冬氨酸。本產(chǎn)品通過大腸桿菌重組表達(dá)，帶有His標(biāo)簽，含有50%甘油，常應(yīng)用于抗體及其相關(guān)蛋白去糖基化。本品既可以在37℃下按照常規(guī)程序進行反應(yīng)，也可以在50℃下快速完成去糖基化。

酶活定義：1 個酶活力單位 (U) 指在10 μl 反應(yīng)體系中，37℃下反應(yīng) 1 h從10 μg 變性 RNase B 中除去超過 95%碳水化合物所需要的酶量。

失活條件：75℃溫育 10 min。

質(zhì)量控制

蛋白純度檢測

使用SDS-PAGE凝膠電泳檢測，蛋白純度不低于95%。

糖苷酶與蛋白酶活性檢測

無可檢出的內(nèi)切糖苷酶F1、F2或F3活性；無可檢出的蛋白酶活性。

使用方法

1.DNA 快速酶切流程

1.1  變性條件下去糖基化

（1）常規(guī)步驟

① 將1~20 μg糖蛋白，1 μl 10× Denaturing Buffer 和 ddH2O（如有必要）混合至總體積10 μl； 

注：10× Denaturing Buffer 在低溫儲存時可能出現(xiàn)白色沉淀，使用前可先在37℃下溫育使其溶解。

② 100℃反應(yīng)10 min使糖蛋白變性后，冰上冷卻，離心 10 s；

③ 加入2 μl 10× PNGase F Buffer，2 μl 10% NP-40，補充ddH2O 使總反應(yīng)體積為20 μl；

④ 加入1~2 μl PNGase F，輕輕混勻，37℃孵育1~3 h。

（2）快速步驟

① 將1~20 μg糖蛋白，1 μl 10× Denaturing Buffer 和 ddH2O（如有必要）混合至總體積10 μl；

注：10× Denaturing Buffer 在低溫儲存時可能出現(xiàn)白色沉淀，使用前可先在37℃下溫育使其溶解。

② 80℃ 反應(yīng)2 min使糖蛋白變性后，冰上冷卻，離心10 s；

③ 加入2 μl 10× PNGase F Buffer，2 μl 10% NP-40，補充ddH2O 使總反應(yīng)體積為20 μl；

④ 加入1 μl PNGase F，輕輕混勻，50℃孵育10 min。

1.2 非變性條件下去糖基化

（1）常規(guī)步驟

① 將1~20 μg糖蛋白，2 μl 10× PNGase F Buffer和 ddH2O（如

有必要）混合至總體積20 μl；

② 加入 2~5 μl PNGase F, 輕輕混勻；

③ 37℃ 孵育 4~24 h。

（2）快速步驟

① 將1~20 μg糖蛋白，2 μl 10× PNGase F Buffer和ddH2

 O（如有必要）混合至總體積20 μl；

② 加入 1 μl PNGase F, 輕輕混勻；

③ 50℃孵育 10 min。

PNGase F 的去除

本產(chǎn)品帶有His標(biāo)簽，反應(yīng)后可選擇與目標(biāo)糖蛋白不同的標(biāo)簽，

通過親和層析將PNGase F去除。